Stiffelio regagne la communauté protestante dont il est le pasteur estimé. Sa femme, la trop faible Lina, a mis à profit sa longue absence pour céder aux délices de l'adultère dans les bras d'un aventurier, Raffaele. Stiffelio n'est pas long à concevoir quelques soupçons mais c'est un autre qui en tirera les conséquences les plus radicales. En effet, Stankar, le propre père de Lina, dévoré de honte et de colère, assassine Raffaele...
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L'Orchestre du Teatro La Fenice